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GT100快速提取水稻DNA

【 发布时间:2016-03-30 】

摘要: 本文介绍了一种用于PCR的植物基因组DNA的快速制备方法。该方法只需将少量(46mg)植物叶片、适量(200μl) TE缓冲液、和一粒钨合金珠放入离心管,在组织细胞研磨器中振动1min破碎组织后,直接取1μl DNA溶液作为PCR的模板。本方法具有简单快速、成本低、扩增效果好等优点,特别适合于大量样品的基因型检测。

摘要:本文介绍了一种用于PCR的植物基因组DNA的快速制备方法。该方法只需将少量(46mg)植物叶片、适量(200μl) TE缓冲液、和一粒钨合金珠放入离心管,在组织细胞研磨器中振动1min破碎组织后,直接取1μl DNA溶液作为PCR的模板。本方法具有简单快速、成本低、扩增效果好等优点,特别适合于大量样品的基因型检测。

关键词水稻,DNA制备,PCR

随着生物技术的迅速发展,PCR技术已广泛应用于遗传育种的各个领域,如种子纯度鉴定、亲缘关系的分析、分子标记辅助育种、基因定位以及转基因植株检测等。在大规模的基于PCR的基因型检测作业中,高效快速的模板DNA制备显得非常重要。自Marmur 1961年建立用十二烷基磺酸钠(SDS)和氯仿从生物细胞中分离提取DNA样品的经典方法以来,人们一直致力于对DNA抽提方法的探讨,并先后报道了一些关于DNA抽提的方法(Dellaporta et al., 1983; 宣朴等,1998;汪秀峰等,2002;周淑芬等,2004)。但这些方法仍然烦琐费时。本研究对作为PCR模板的植物基因组DNA制备方法作了简化,只需将少量叶片、适量TE缓冲液、和一粒钨合金珠放入离心管,在组织细胞研磨器中振荡约5min破碎组织后,直接取1μl DNA溶液作为PCR的模板。本方法具有简单快速、成本低、扩增效果好等优点,特别适合于大规模的基因型检测。

材料与方法

1.1 试验材料
试验材料为粳稻品种台中65T65)及其杂种不育基因Sc的近等基因系E5,以及它们杂交组合构建的F2群体,以及拟南芥(Arabidopsis thaliana)生态型Columbia

1.2 基因组DNA制备方法
剪取(或用手摘取)水稻苗或成株叶片(剪成约35mm小段)或拟南芥叶片约46mg1215mg,或2530mg,放入2ml离心管中(注:2ml离心管的底部较宽,利于钨合金珠的振荡),加入200μl TE 10mmol/L Tris, pH8.0; 0.5mmol/L EDTA, pH8.0. 注:本TE中的EDTA浓度是常规TE1/2)或200μl去离子水,放入一粒3mm直径的钨合金珠,在高通量组织研磨仪GT100振动约1min,把叶片打碎。取17μl溶液以琼脂糖凝胶电泳检测模板DNA质量,取1μl溶液用于PCR扩增。

1.3 PCR引物反应
根据公共数据库的水稻和拟南芥基因组序列设计PCR引物(表1),由英俊公司合成。Taq酶从杰顺公司购买。

1 PCR引物序列

引物

引物序列

PR1

5’-TCTGTACAAGTTGAGGAATCTCCG-3’

5’-TGCCACCCACAGCAAGCCTTATGA-3’

PR2

5’-ACCCCATGGCGACGAATTCC-3’

5’-CAGATTAAGGCAGGAAGTCC-3’

PA

5’-GAAACTGATCAGTTGCTTTCAC-3’

5’-CTGCTACACAATCTCGTTATGGAG-3’

L14-121

5’-CTTGACAATTGCAAGGCCAA-3’

5’-GAGGTAGGCATGAGACATGC-3’

J04-91

5’-GTGCGGATCGATCGGCAGCA-3’

5’-GCTCAGATCCGGCCAGATTC-3’

P24-83

5’-CAGAACAGCATTCAGGCATC-3’

5’-ATCCTGATAATGTGTGGCGC-3’

P24-93

5’-CATTGGTTAAAGGATGGTAC-3’

5’-TAGTACTGCTAGGACCATCC-3’

注:PA为拟南芥引物,其余为水稻引物,其中L14-121P24-93为插入/缺失(InDel)标记引物。

每个PCR反应液(20μl)组成为:1× Buffer0.2mmole/L dNTPs, 1U Taq,250nmole/L每种引物,1μl上述DNA溶液。PCR反应在My Cycler (BioRad)热循环仪上进行。用引物反应程序为94预变性3min,扩增35个循环,每个循环94 20s 55~58 30s72 60s (InDel标记的PCR30s);最后72 2min

1.4 聚丙烯酰胺凝胶电泳及检测 

1.4.1 聚丙烯酰胺凝胶的制备
配制6%的聚丙烯酰胺凝胶100ml工作液:分别加5.7 g丙烯酰胺 (Acri)0.3g N,N-亚甲基双丙烯酰胺(Bis-Acri),12g尿素,10ml 10×TBE,最后加水至100ml。灌胶前,每10ml胶液加入80μl 10%过硫酸铵,4μl四甲基乙二胺(TEMED),摇匀后迅速灌胶,胶凝固后即可点样电泳,并通过银染检测实验结果。

1.4.2 银染 
先用0.1% AgNO3染色液染色1015min,再用显影液(100mL中含NaOH 0.5g、四硼酸钠0.019g, 0.4mL甲醛)显色,等条带清晰后,直接用自来水冲洗终止显色反应,用凝胶成像仪(BioRad)或数码相机拍照并记录实验结果。

结果与讨论

2.1 PCR模板DNA的快速制备
本方法是将少量植物叶片在TE溶液或去离子水中,经钨合金珠在离心管内的振荡破碎,直接获得DNA溶液。用高通量组织研磨仪GT100一次可操作192个样品。琼脂糖凝胶电泳表明,用TE和去离子水都可获得分子量较大的DNA片段(图1A)。用TE制备的DNA4下可保存10天以上,在冷冻下可保存半年。而用去离子水制备的DNA容易降解,保存时间较短,因此我们采用TE为主。

 

本方法制备的水稻和拟南芥基因组DNA

注:A: TE(泳道15)和去离子水(泳道610)制备的水稻基因组DNA (46mg叶片/200μl) M为分子量标记。B, C: 200μl TE制备的不同浓度的水稻(B)和拟南芥(C)基因组DNA。泳道1346mg叶片;461215mg叶片;79为约2530mg叶片。

2.2 不同量的模板DNAPCR扩增效果
本方法制备的基因组DNA没有经过纯化,含有各种可能抑制Taq酶活性的杂质。因此,加入过多的粗制DNA可能会影响PCR反应。为了找出适合于PCR反应的DNA量,我们在一定量的TE200μl)中加入不同量(46mg1215mg2530mg)的水稻和拟南芥叶片制备基因组DNA(图1B, C)。选用2对水稻的引物(PR1PR2,扩增产物长度分别为540bp890bp)和1对拟南芥引物(PA, 扩增产物长度为1 kb),取1μl DNA20μl的体系进行PCR反应。结果表明,对扩增较小的DNA片段,所有模板都能扩增出产物,但用46mg叶片制备的模板DNA获得最好的扩增效果(图2A)。对扩增较大的DNA片段,只有用46mg叶片制备的模板DNA获得较稳定的扩增效果(图2B, C)。

不同量的基因组DNA为模板的PCR反应的琼脂糖凝胶(1%)检测

注:ABC分别为用引物PR1PR2,和PA进行PCR。在所有反应(20μl)含有1U Taq酶和1μl基因组DNA;泳道134679分别为以46mg1215mg,和2530mg叶片在200μl TE中制备的基因组DNA

本实验说明,用46mg(可以多至约10mg)叶片/200μl TE的比例制备基因组DNA溶液所含的杂质浓度较低,加入1μlDNA溶液到20μl反应体系中不会抑制Taq酶的活性。而加入1μl较高浓度的模板DNAPCR反应的抑制作用较大。由于模板DNA量较少(约12ng/μl),PCR循环数比用较大量的纯化DNA模板(一般用20~50ng)的PCR要多些(多35个循环)。虽然可以将用较多叶片制备的模板DNA稀释使用或加入较少量(<1μl)的模板DNA也能获得好的PCR效果,但从简化操作步骤,提高工作效率考虑,确定最佳的经验值对效率化的大规模样品检测尤为重要。由于加入的样品叶片量有一个合适的范围,在实际操作中,并不需要所有样品都用天平称取,以经验目测估算即可。

2.3用于分子标记的基因型分析
由于用本方法制备的基因组DNA可以PCR扩增出较大的目的片段,对于PCR分子标记,如微卫星(SSR)、插入/缺失(InDel)、单核苷酸多态(SNP)等检测较短的DNA片段(一般<200bp)应该是可行的。我们用4对位于水稻籼粳杂种花粉不育基因ScYang et al., 2008)连锁区的InDel标记引物(表1)对F2群体进行的基因型分析。图3显示了部分结果,所有标记的PCR扩增效果稳定,聚丙烯酰胺凝胶电泳的DNA条带均清晰易辨。

InDel分子标记的水稻基因型检测

注:AD分别为用引物L14-121J04-91P24-83,和P24-93PCR。左边起第1和第2泳道分别为亲本E5T65、其它泳道均为F2个体。

已报道植物基因组DNA制备的方法很多,如经典的SDS法、CTAB法,另外还有一些简化的制备方法,SDS一步法(王会文等,2002)、微波炉水煮法(黄小乐等,2002)、TE研磨法(罗文永等,2002)、NaOH处理幼叶直接作为PCR模板法(汪秀峰等,2002)、简易提取法(陈文岳等,2005)、剪切法(赵红霞等,2006)。对需要对大量样品进行基因型分析的研究来说,这些方法的操作效率不够高,或制备的模板DNA的扩增结果不理想,常常不能扩增出目的片段。本研究提出的DNA制备方法简单,大大缩短了时间,适合操作大量的样品,而且PCR效果和重复性好,需要叶片量也很少,所需的仪器(高通量组织研磨仪GT100)价格低,因此实验成本低。我们用本方法已制备了数万的水稻样品用于各种分子标记(SSRInDelSNP)和转基因的基因型检测。

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